*CN101948837A*
(10)申请公布号 CN 101948837 A(43)申请公布日 2011.01.19
(12)发明专利申请
(21)申请号 201010243832.8(22)申请日 2010.08.03
(71)申请人浙江大学
地址310027 浙江省杭州市西湖区浙大路
38号(72)发明人徐志南 黄磊 蔡谨 张丹萍(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公
司 33200
代理人周烽(51)Int.Cl.
C07K 1/22(2006.01)C07K 1/18(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C07K 14/475(2006.01)
(54)发明名称
在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法(57)摘要
本发明公开了一种在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法：该方法由hIGF-1构建hIGF-1融合蛋白蛋白相关基因设计和合成、表达载体、用所述表达载体转化大肠杆菌宿主构建基因工程菌、用所述基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白、hIGF-1融合蛋白的分离、用肠激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合标签、通过培养NIH3T3细胞检测hIGF-1的活性等步骤组成；本发明采用串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为hIGF-1，中间添加了6个His标签，使表达产物更加稳定，分离方法更简单，价廉，因此，本发明具有广泛的应用前景。
权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页
附图 2 页
CN 101948837 ACN 101948837 ACN 101948839 A
权 利 要 求 书
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1.一种在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)设计和合成hIGF-1蛋白相关基因：设计上下游引物，并合成hIGF-1基因，合成的hIGF-1基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。
(2)构建hIGF-1融合蛋白表达载体。
(3)用表达载体转化大肠杆菌宿主构建基因工程菌。(4)用基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白。(5)亲和层析分离纯化hIGF-1融合蛋白。
(6)用肠激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合标签。(7)阳离子交换分离纯化。
2.根据权利要求1所述在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为：将适量Ni-NIA树脂置于层析柱内，用上样缓冲液平衡，然后加入细菌裂解液的上清并使其在柱内平衡，用结合了His标签的融合蛋白用洗脱液进行洗脱。
3.根据权利要求1所述在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体为：将按照步骤(5)亲和纯化后的hIGF-1融合蛋白通过凝胶过滤层析将原有缓冲液置换成肠激酶酶切的缓冲液，然后将经过缓冲液置换的hIGF-1融合蛋白在20℃下加肠激酶消化9h。
4.根据权利要求1所述在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，其特征在于，所述步骤(7)具体为：将适量SP阳离子交换树脂置于层析柱内，用上样缓冲液平衡，然后加入肠激酶酶切后的融合蛋白溶液并使其在柱内平衡，并用5倍体积的上样缓冲液冲柱，目标蛋白hIGF-1用洗脱缓冲液进行洗脱，纯化后的hIGF-1蛋白用G10凝胶柱脱盐后，经冷冻干燥得到hIGF-1蛋白粉末。
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说 明 书
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在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法
技术领域
本发明涉及生物技术中的生物医药领域，尤其涉及一种应用DNA重组技术，即构建硫氧还蛋白和hIGF-1融合蛋白，利用大肠杆菌宿主菌Rosetta-gami(DE3)来表达制备hIGF-1融合蛋白，并利用肠激酶切割融合蛋白最终得到hIGF-1的方法。
[0001]
背景技术
人的类胰岛素生长因子-1(hIGF-1)是由70个氨基酸组成的单链蛋白，含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处，故称为类胰岛素生长因子。有关研究表明，hIGF-1具有促进生长发育和物质代谢等作用，因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-1的影响。为此，IGF-1倍受重视，在治疗胰岛素抗性糖尿病、神经损伤、矮小症、骨质疏松、分解代谢疾病等方面，具有广阔的应用前景。[0003] 到目前为止，包括大肠杆菌，酵母，无细胞体系，转基因植物和动物在内的一系列表达体系已经被用于表达hIGF-1。在大肠杆菌中hIGF-1的产量达到了8.5g/L，但是90％都是以包涵体形式存在的。在酵母中hIGF-1的表达量只有55mg/L。相似的，hIGF-1的表达量在转基因植物和动物中也很低。最近实验发现在大肠杆菌无细胞体系中，可溶性hIGF-1的产量达到了400mg/L，但是无细胞体系的高昂费用阻止了hIGF-1的大规模生产。因此提高hIGF-1的可溶表达迫在眉睫。
[0002]
发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在重组大肠杆菌中的高效生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，该方法高效可溶表达，稳定存在，分离方法简单，成本低，适用于大规模生产hIGF-1。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，该方法包括以下步骤：[0006] (1)设计和合成hIGF-1蛋白相关基因：设计上下游引物，并合成hIGF-1基因，合成的hIGF-1基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列；[0007] (2)构建hIGF-1融合蛋白表达载体；
[0008] (3)用表达载体转化大肠杆菌宿主构建基因工程菌；[0009] (4)用基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白；[0010] (5)亲和层析分离纯化hIGF-1融合蛋白；
[0011] (6)用肠激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合标签；[0012] (7)阳离子交换分离纯化。[0013] 本发明的有益效果是：由于大肠杆菌菌株Rosetta-gami(DE3)携带有氯霉素抗性的质粒，它能够提供编码AGG，AGA，AUA，CUA，CCC和GGA稀有密码子的tRNA，因此可以有效消除成熟的hIGF-1(含有4个AGG，2个CCC和1个CUA稀有密码子)在大肠杆菌中稀有密码子的负面影响；同时该菌株将trxB和gor两条主要还原途径双突变，因此它可以促进
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hIGF-1融合蛋白二硫键的形成，提高目标蛋白的可溶表达。本发明采用串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为hIGF-1，使表达产物更加稳定，分离方法简单，价廉。经过发酵条件优化后，可溶性hIGF-1融合蛋白的产量达到了2.06g/L。因此，本发明具有广泛的应用前景。附图说明
图1是pET32-hIGF-1质粒构建图；
[0015] 图2是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-1中，不同表达温度对目标蛋白表达的影响的图，其中，(a)为可溶蛋白，(b)为不可溶蛋白；[0016] 图3是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-1中，诱导时间对目标蛋白表达的影响图，1、3、5分别代表在对数生长期前期、中期、后期和稳定期诱导的可溶蛋白；2、4、6代表相应的不可溶蛋白；
[0017] 图4是亲和纯化后收集的洗脱样品的SDS-PAGE电泳图，1为纯化前样品，2为洗脱样品，3为纯化后的目标蛋白；
[0018] 图5是肠激酶消化后的SDS-PAGE电泳图，1为肠激酶切割后的hIGF-1融合蛋白，2为肠激酶切割前的hIGF-1融合蛋白。
[0014]
具体实施方式
[0019] 本发明相关基因的结构特点是组成融合蛋白的两个蛋白分别是硫氧还蛋白和hIGF-1，硫氧还蛋白可以促进hIGF-1二硫键形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能性增加；hIGF-1基因序列在第69个氨基酸末端连接有两个终止子顺序TAA和TGA，使得蛋白的表达更有效的得以终止。两个蛋白之间引入含6个组氨酸标签，大大方便了该蛋白的分离纯化。
[0020] 本发明人的类胰岛素生长因子-1(hIGF-1)的高效生产方法采用基因工程菌发酵法生产，包括以下步骤：[0021] 1、设计和合成hIGF-1蛋白相关基因[0022] 1.1设计引物
[0023] 根据pET32a(+)(购于Invitrogen)的多克隆位点序列，在5’端和3’端的两条引物上分别加上NcoI和XhoI限制性内切酶位点，同时在hIGF-1基因序列第69个氨基酸末端连接有两个终止子顺序TAA和TGA，使得蛋白的表达更有效的得以终止。上下游引物分别为5’-ATCC
GGACCGGAGACGCTCTGCGGGCTGAGC-3’和5’-GGCTCGAG
AGCTGACTTGGCAGGCTTGAGGGGTGC-3’(酶切位点用下划线表示，起始和终止密码子用粗体表示)
[0024] 1.2合成hIGF-1基因
[0025] 采用PCR法扩增目的基因，扩增程序如下：预变性94℃，10min；变性95℃，30s，复性60℃，30s；延伸72℃，1min，共30个循环，最后一次反应延伸时间为10min。取PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒提取胶中的PCR产物。连接到克隆载体pMD19-T(购于宝生工(TAKARA))，得重组质粒“pMD19-hIGF-1”，再转到DH5α中，进行测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
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2、构建hIGF-1融合蛋白表达载体
[0027] 将pMD19-hIGF-1用NcoI和XhoI双酶切后进行琼脂糖电泳，回收hIGF-1基因片段。pET32a(+)空质粒同样用这两个酶进行酶切后纯化。将回收的hIGF-1基因片段和酶切纯化后的载体混合进行连接，构建表达质粒pET-32a-hIGF-1(图1)。[0028] 连接产物转化DH5α感受态细胞，接种到含氨苄青霉素的琼脂糖平板上进行抗性筛选。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后用NcoI和XhoI进行双酶切。酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检验阳性克隆。将阳性克隆的质粒进行DNA序列测定。[0029] 3、用表达载体转化大肠杆菌宿主构建基因工程菌
[0030] 将测序结果正确的表达质粒转化到表达菌株Rosetta-gami(DE3)(购于Invitrogen)中，然后接种到含氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Chl)、卡那霉素(Kan)和四环素(Tet)的琼脂糖平板上进行抗性筛选。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。[0031] 4、用基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白[0032] 4.1培养细菌和表达蛋白
[0033] 取5ul甘油管中菌液加入到5ml含氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Chl)、卡那霉素(Kan)和四环素(Tet)的LB培养液中，37℃，200转/分，摇床培养过夜。次日取1ml菌液，加入到10倍含相应抗生素的LB培养基中，在37℃下培养至OD＝1.0，然后加入IPTG至终浓度为0.1mM～1.0mM，在15℃～40℃下培养2h～10h。[0034] 4.2裂解细菌[0035] 收集菌体，5000×g离心5min，先用20mM Tris-Cl，pH 8.0洗三次，然后再用20mM Tris-Cl，pH 8.0，1mM EDTA，100mM NaCl重悬，超声破碎后再以12000×g离心10min，取上清。沉淀用洗液20mM Tris-Cl，pH 8.0，1mM EDTA，100mM NaCl，1％Triton X-100洗涤，12000×g离心10min后将不溶组分用8M尿素溶解蛋白，再以12000×g离心10min，上清即为我们处理过后的不溶组分。[0036] 4.3分析蛋白
[0037] 使用浓度为5％的浓缩胶和浓度为15％的分离胶进行Tricine-SDS-PAGE电泳，采用考马斯亮蓝进行染色分析。通过Bradford法来测定总蛋白量。[0038] 5、亲和层析分离纯化hIGF-1融合蛋白[0039] 将适量Ni-NIA树脂置于层析柱内，用上样缓冲液平衡(50mMNaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)。然后加入细菌裂解液的上清并使其在柱内平衡，结合了His标签的融合蛋白用洗脱液(50mMNaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)进行洗脱(图4)。[0040] 6、用肠激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合标签
[0041] 将亲和纯化后的hIGF-1融合蛋白通过凝胶过滤层析将原有缓冲液置换成肠激酶酶切的缓冲液(50mM Tris，2mM CaCl2，50mM NaCl，pH 8.9)。然后将经过缓冲液置换的hIGF-1融合蛋白在20℃下加肠激酶消化9h(图5)。[0042] 7、阳离子交换分离纯化hIGF-1和hIGF-1活性检测
[0043] 将适量SP阳离子交换树脂置于层析柱内，用上样缓冲液平衡(30mMKH2PO4-Na2HPO4，30mM NaCl，pH 6.7)。然后加入肠激酶酶切后的融合蛋白溶液并使
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其在柱内平衡，并用5倍体积的上样缓冲液冲柱，目标蛋白(hIGF-1)用洗脱缓冲液(30mM KH2PO4-Na2HPO4，1M NaCl，pH 7.0)进行洗脱。纯化后的hIGF-1蛋白用G10凝胶柱脱盐后，经冷冻干燥得到hIGF-1蛋白粉末。
[0044] 通过培养NIH3T3细胞来检测hIGF-1多肽的生物活性，在无血清培养基中实验组加入50μg/ml hIGF-1，对照组不加hIGF-1，培养24h后，观察对照组和实验组中NIH3T3细胞的生长情况来测定hIGF-1的生物活性。实验结果表明实验组的NIH3T3细胞培养状态较好，边界清楚，大小均一；而对照组的NIH3T3细胞基本没有增值。由此验证了hIGF-1具有代替牛血清促进细胞生长的功能。
[0045] 下面根据附图和实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。[0046] 实施例1
[0047] 取5ul甘油管中菌液加入到5ml含氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Chl)、卡那霉素(Kan)和四环素(Tet)的LB培养液中，37℃，200转/分，摇床培养过夜。次日取1ml菌液，加入到10倍含相应抗生素的LB培养基中，在37℃下培养至OD＝1.0，诱导剂浓度为1.0mM，分别在15℃、25℃下培养过夜，30℃、34℃、37℃和40℃下培养4h。表达的最适温度为34℃，可溶融合蛋白的表达量达到1.2g/L(图2)。[0048] 实施例2[0049] 同实施例1，次日接种1ml菌液，加入到10倍含相应抗生素的LB培养基中，确定工程菌在34℃下的生长曲线，分别取对数生长期前期、中期、后期和稳定期进行诱导，诱导时培养温度为34℃，诱导剂浓度为1.0mM，诱导后培养4h。[0050] 最适诱导时间为对数生长期中期，即接种4h后，可溶融合蛋白的表达量达到1.56g/L(图3)。[0051] 实施例3[0052] 同实施例1，次日接种1ml菌液，加入到10倍含相应抗生素的LB培养基中，于34℃下培养，在对数生长期中期诱导，诱导剂IPTG浓度分别为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM和1.0mM，加入诱导剂后于34℃培养4h，结果表1所示。[0053] 最适诱导剂浓度为0.25mM，在该诱导浓度下可溶融合蛋白的表达量为1.83g/L。[0054] 实施例4[0055] 同实施例1，培养种子液。次日接种1ml菌液，加入到10倍含相应抗生素的LB培养基中，于34℃下培养，在对数生长期中期诱导，诱导剂IPTG浓度为0.25mM，加入诱导剂后在34℃下分别培养2h、4h、6h、8h和10h。[0056] 最适诱导后培养时间为8h，可溶融合蛋白的表达量是2.06g/L。
[0057] 表1IPTG浓度和诱导后培养时间对可溶性hIGF-1融合蛋白表达的影响
[0058]
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上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
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